抗精子抗体的检测方法

　　（三）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）

　　【原理】

　　本法用带正电荷的聚氯乙烯（PVC）微量反应板，将精子抗原吸附到聚氯乙烯固相载体表面，其固相抗原可与待测标本中抗精子抗体（As-Ab）结合，并与加入的抗人 IgG 酶结合物起反应，形成抗原抗体酶结合物，最终在酶底物作用下而显色。

　　【试剂】

　　（1）包被液：0.01mol/L pH 9.6碳酸钠缓冲液：

　　Na2CO3 1.06 g

　　NaHCO3 0.84 g}加双蒸水至 1 000mL。

　　（2）缓冲液：0.01mol/L pH 7.4 PBS：

　　【方法】

　　（1）精子抗原制备：筛选收集精液常规检查正常的精液，用生理盐水反复离心洗涤，尽可能除去精浆，经超声波超声粉碎，10～ 15min 高速离心，吸上清，测定上清液蛋白浓度，将蛋白浓度稀释为 3.5～ 5.0μg/mL，为精子抗原溶液。

　　（2）反应板包被抗原：将人精子抗原稀释成 3.5～ 5μg/mL，包被液加到聚氯乙烯微量测定板内，每孔 100μL，置 4℃ 冰箱过夜。

　　（3）封闭处理：次日早晨，倾去抗原溶液，用洗涤 PBS洗 3次，每次 5min，每次洗涤后都要将板在纸上拍干，再加入 1% 的聚乙烯醇溶液 200μL封闭，置室温 1h后同上法洗涤。

　　（4）加待测样品：样品用 PBS稀释 100倍，每孔加入 100μL，同时加 As-Ab血清及正常处女血清作分别阳性和阴性对照，置 37℃ 温育 1h，同上法洗涤。

　　（5）加酶结合物：HRP-Protein A 以 1∶640稀释，每孔加入 100μL，置室温 1h，同上洗涤。

　　（6）酶反应：加新鲜配制的 OPD 底物溶液，每孔加入 50μL，置室温暗处 10min，再加10% H2SO4终止液每孔 50μL。

　　（7）结果判定：用酶标测定仪 490μm测其 OD 值，OD 值≥2.0时为阳性。

　　（四）生物素-亲和素酶联免疫吸附试验（biotin-avidin enzyme linked immunosorbentassay，BA-ELISA ）

　　【原理】

　　待测抗体与固相抗原反应后，再加入生物素化第二抗体，形成抗原抗体生物素化第二抗体复合物，然后与酶标亲和素作用，并通过相应底物而显色。

　　【试剂】

　　（1）生物素化羊抗人 IgG，IgA，IgM。

　　（2）酶标亲和素。

　　（3）缓冲系统溶液。

　　1）洗涤液：Tris-Tween-20溶液（0.02mol/L，pH 7.4）：

　　1.0mol/L Tris 20mL

　　1mol/L HCl 15mL

　　Tween-20 0.5mL

　　加蒸馏水至 1000mL

　　2）包被液：碳酸盐缓冲液（pH 9.6）：

　　Na2CO3 0.15g

　　NaHCO3 0.29g

　　加蒸馏水至 100mL，可使用 2周。

　　3）稀释液：PBS-Tween-20缓冲液（pH 7.4）：

　　NaCl 0.8g

　　Na2HPO4·12H2O 2.9g

　　KH2PO4 0.02g

　　KCl 0.02g

　　Tween-20 0.05mL

　　新鲜小牛血清 10mL

　　加蒸馏水至 100mL

　　4）底物溶液

　　A 原液：

　　Na2HPO4·12H2O 92g

　　柠檬酸 25.8g

　　硫柳汞 0.1g

　　加蒸馏水至 400mL

　　最后再加 30% H2O225mL，补足蒸馏水至 500mL，4℃ 可贮存 1年以上。

　　B 工作液：4mg邻苯二胺（OPD）溶于 9mL 蒸馏水中，加原液 1mL。

　　（4）1% 聚乙烯醇溶液

　　【方法】

　　（1）在 40孔微量测定板中加入 2～ 6μg/mL人精子膜抗原包被液，每孔 100μL，4℃ 过夜。加 1% 聚乙烯醇封板 37℃ 、30min，用洗液洗 3次。

　　（2）待检血清 1∶1000稀释（宫颈黏液 1∶100）每孔 100μL，37℃ 温育 60min，同上洗涤。

　　（3）1∶100生物素化羊抗人 IgG，IgA 或 IgM，每孔 100μL，37℃ 、60min，同上洗涤。

　　（4）1∶100酶标亲和素，每孔 100μL，22℃ 温育 30min，同上洗涤。

　　（5）每孔加底物 100μL，37℃ 作用 5～ 10min，加 8mol/L H2SO450μL 终止反应。

　　（6）用酶标检测仪测 A490光密度（OD）值，为双份待测孔均值与双份阴性孔均值之差，血清取 OD 值 0.20（宫颈黏液取 0.10）作为 AsAb阳性的判断标准。

　　（五）生 物 素-亲 和 素 复 合 物 酶 免 疫 吸 附 试 验（avidin-biotin complex enzyme linked im-munosorbentassay，ABC-ELISA）

　　【原理】

　　此法将精子抗原与待测抗体作用，再与生物素化第二抗体结合形成抗原抗体反应体系，再加入预先使亲和素与酶标生物素按一定比例共温形成亲和素生物素过氧化物酶复合物，使之与生物素化抗抗体作用，此时 ABC 中尚未饱和的亲和素结合部位可与抗抗体分子上的生物素相结合，从而形成 ABC 标记体系，最后通过底物显色，达到检测 As-Ab的目的。

　　【试剂】

　　（1）包被液、洗涤缓冲液、封闭液、底物溶液同 ELISA 法。

　　（2）生物素化鼠抗人 IgG。

　　（3）ABC 酶复合物。

　　【方法】

　　（1）精子抗原制备、包被、封闭处理同 ELISA 方法。

　　（2）加待测样品：待测血清按 1∶100稀释，每孔 100μL，置 37℃ 温育 1h，用洗涤缓冲液洗涤 3次，每次 5min，每次洗涤后，将板在干纸上拍干，然后加入 As-Ab 血清和正常处女血清（两者均按 1∶100稀释）作为阳性和阴性对照。

　　（3）加生物化抗体复合物：生物素化鼠抗人 IgG 按 1∶200稀释，每孔 100μL置 37℃ 温育1h，洗涤 4次拍干。

　　（4）加 ABC 复合物：ABC 复合物按 1∶100 稀释，每孔 100μL，置 37℃ 30min，洗涤 4 次拍干。

　　（5）加底物反应：加新鲜配制的 OPD 底物溶液，每孔 50μL，置室温暗处 10min，再加10% H2SO450μL 终止反应。

　　（6）结果判定：用酶标仪 490μm测其 OD 值，OD≥2.0时判定为阳性。

　　五、混合抗球蛋白反应试验（m ixed antiglobulin reaction test，M AR test）

　　【原理】

　　本法由 Coombs及 Rumke于 1973年首先报道，原理为经典的 Coombs试验。由于在本试验中阳性表现为活动精子与敏化乳胶（或红细胞）的混合凝集，故又称为混合凝集试验。先制备吸附有人 IgG 的乳胶颗粒或绵羊红细胞，然后将精液与包被的乳胶颗粒一起作用，再与抗人 IgG 抗血清反应。如果精子包被有 As-Ab，可形成活动的精子与乳胶颗粒的混合凝集物。反之，乳胶颗粒则互相黏着成团。

　　【试剂】

　　（1）人 IgG 包被的乳胶颗粒或绵羊红细胞。

　　（2）抗人 IgG 抗血清。

　　【方法】

　　（1）直接法：检测活动精子表面的精子结合抗体。

　　1）取新鲜液化待检精液 10μL 于载玻片上。

　　2）加 10μL 乳胶抗原并用盖玻片充分混匀。

　　3）加 10μL 抗血清，再用盖玻片充分混匀，盖上盖玻片，5min内镜下（400× ）看结果。

　　（2）间接法：检测血清、生殖道分泌液中的精子抗体。

　　1）待检血清或生殖道分泌液经 56℃ 30min灭活。

　　2）待检血清或生殖道分泌液 5μL 加培养液（如 RPMI1640）35μL 于小试管中。

　　3）加新鲜液化正常人精液 40μL 混匀，37℃ 1h。

　　4）取上述保温后混合物 10μL 于载玻片上。

　　5）以下按直接法 2）、3）步骤操作。

　　【结果判定】

　　没有包被抗体的精子可以在乳胶颗粒之间自由泳动，而乳胶颗粒自己粘附成团。如果精子上包被有抗精子抗体，活动精子粘着乳胶颗粒，开始时可以看到这些活动精子周围粘着几个或一串乳胶颗粒来回游动，最后凝聚块变得越来越大，粘附到一起的精子只能在原地摆动。计数粘着有乳胶颗粒的活动精子的百分率（% ）。当 40% 或更多运动精子粘附有这种颗粒时，诊断为免疫性不育。10% ～ 40% 运动精子被粘附时，为可疑免疫性不育。

　　六、免疫珠试验（im m unobead test，IBT）

　　【原理】

　　免疫珠是以共价键结合了兔抗人免疫球蛋白抗体的聚丙烯酰胺珠。由活动精子与交联珠间的连接判断精子表面存在由精子抗体及相应的免疫球蛋白类型。当精子在免疫珠悬液中游动时，那些表面有抗体的精子粘附到免疫珠上。因此，可以测定表面包有抗体的精子比例。间接 IBT 是现时公认检测体液标本抗精子抗体最为敏感而特异的方法。

　　【试剂】

　　（1）正常供者精子，采自新鲜射出精液，精子上应无抗精子抗体包被，存活率为 70% 以上，活动度 a、b级精子应为 70% 以上。

　　（2）免疫珠：羊抗人 IgG、IgA（BioRad公司）。

　　（3）缓冲液 Tyrode溶液（g/L）：

　　CaCl2 0.2

　　NaCl 8.0

　　KCl 0.2

　　NaHCO3 1.0

　　NaH2PO4 0.05

　　葡萄糖 1.0

　　MgCl2·6H2O 0.2

　　用前需用 0.22μm滤器过滤除菌。

　　（4）BSA 溶液：0.4% w /v（以 Tyrode溶液配制）。

　　【方法】

　　（1）直接法：检测去精浆精子表面附着的免疫球蛋白。

　　1）2个离心管中分别加入抗 IgG 和抗 IgA 免疫珠 0.2mL、用 0.4% BSA 缓冲液稀释至10mL。

　　2）在另一支离心管中加入 0.2mL 精液，并且用 0.4% BSA 溶液稀释成 1mL。

　　3）将 3支离心管离心 500 × g 5min，弃去上清，将免疫珠重悬在 10mL 0.4% BSA 溶液中。

　　4）如步骤 3）再次洗涤精液后，将沉淀的精子重悬于 0.2mL 0.4% BSA 溶液。

　　5）在载玻片的两端分别加 5μL IgG 和 IgA 免疫珠。

　　6）再加 5μL 精液悬液到免疫珠上，用盖玻片边缘充分混匀，分别在两滴混合液上盖上一张盖玻片。

　　7）湿盒静置 15min。

　　8）用 400× 的相差或普通光学显微镜观察，分别记录含有抗 IgG 和 IgA 免疫珠的混合物中粘有免疫珠的活动精子百分率% 。

　　（2）间接法：检查血清或精浆中抗精子抗体。

　　1）将正常供者精子用 0.4% BSA 溶液如直接法中所述洗涤 2次，同时如直接法准备免疫珠悬液。

　　2）将上述洗涤过的精子，用 Tyrode氏溶液调整精子浓度至 50×106/mL。

　　3）将 50μL 经过洗涤的精子加到 50μL 待检血清或精浆中，于 37℃ 孵育 1h。

　　4）如直接法步骤，将精子洗 2次，再如直接法 5）至 8）步骤进行测定。

　　【结果判定】

　　两种方法的结果判定均为：≥10% 活动精子粘有免疫珠，结果为（ + ）。

　　注意：温度对精子活动影响很大，实验过程应保持室温在 22℃ 左右。

　　七、酶免疫斑点试验（enzym e im m unoblotassay）

　　【原理】

　　将滤纸或纤维素膜作为固相载体交联或吸附抗原后、再分别与未知抗体和酶标第二抗体反应，经酶催化底物而显色，从而检测相应抗体。

　　【试剂】

　　（1）硝酸纤维膜，孔径为 0.3μm。

　　（2）2% BSA（蒸馏水配制）。

　　（3）0.01mol/L pH 7.2 PBS。

　　（4）抗人 Ig-HRP 结合物。

　　（5）二氨基联苯胺（DAB）底物溶液：

　　将 30mgDAB 溶于 0.05mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液 100mL 中，过滤，4℃ 暗处贮存，临用时加 3% H2O2，最终浓度为 0.05% 。

　　【方法】

　　1）微孔滤膜切成 4mm ×50mm 的长条，用铅笔标明位置，点距 4mm，浸于 PBS中 15min，用滤纸吸干。

　　2）在滤膜相应位置点精子抗原 2μL，4℃ 作用 30min，吸干，PBS漂洗 3次。

　　3）浸于 2% BSA 溶液中，4℃ 封闭 15min，洗 3次，吸干。

　　4）1∶4待检血清点样 0.5μL，4℃ 15min，洗 3次，吸干。

　　5）浸于酶标二抗溶液（1∶1 500）中，4℃ 15min，洗 4次，每次 5min。

　　6）DAB-H2O2底物显色 10min，PBS洗 0.5min。

　　【结果】

　　呈现褐色斑点者为阳性，无色或微黄色为阴性。

（实习编辑：黄秀杰）

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