（二）定量的精子制动化试验
为了观察人体血液中抗精子抗体的动态变化，了解病情的转归及治疗效果，实施抗体的定量测定是非常必要的，但历来所用的抗体定性测定方法，都不能解决这一问题。虽然把原血清作对倍稀释之后做精子凝集试验，也可大致了解抗精子抗体的强弱程度，但精子凝集试验难以把非特异性的精子凝集与抗精子抗体引起的特异性精子凝集相鉴别。而且通常用于凝集试验的被检血清都要先行稀释 4～ 16 倍，判断凝集的精子从 2 条精子的小凝集块到上百条精子以上的大凝集块，强弱差距很大，所以要定量测定抗精子抗体的效价很困难。
半定量精子制动化试验是以被检原血清进行抗精子抗体测定，当抗体效价不很强，被检血清的精子活动率（T）在 60% ～ 20% 之间时，与对照血清的精子活动率（C）可以进行比较（C/T），若血清抗体效价很强，T 的精子活动率在 3% ～ 1% 之间，C/T 比较则失去意义。假如T 的活动率变为 0，C/T 比较值（SIV）变成无限大（∞ ），这时就无法测出抗体量到底有多少。定量的精子制动化试验的特点在于先把被检血清做对倍稀释，按半定量法求出各稀释度的精子活动率（T），随后测定标准阴性对照血清的精子活动率（C），然后按公式 C - T/C × 100计算出精子制动化率（Y）。当抗体效价高时，精子活动率（T）接近于 0，而 Y 值接近 100，随着血清对倍稀释，T 值逐渐接近 C 值，这时 Y 将接近于 0。若把血清稀释倍数作横轴，把各稀释度的 Y 作纵轴，根据 Y 的变化，就可以绘出精子制动化率递减图，将递减曲线与 50% Y 的直线相交点，称为 50% 精子制动化指数，这个指数的血清稀释倍数，就是我们要寻找的 50%精子制动化抗体效价（SI），SI值不但能准确地表示抗体量，而且重现性很好。由于检测的指标是精子活动率，所以反应时间是关键因素。香山浩二等人研究指出，1～ 3h之内测定的 SI值误差性小，随着反应时间延长，SI值的误差性变大。因此，要作不同检体的 SI比较，必须规定在一定时间内进行，如果每次测定有标准阳性血清的 SI作对比，这对修正被检血清 SI的误差性极为重要。临床测定以 2～ 3h内判断 SI值为最好。
【准备】
（1）待检血清：从门诊患者静脉抽血，分离血清，经 56℃ 30min灭活处理，置 - 20℃ 冻存备用。
（2）精子悬浮液制备：用手淫法，取健康男子精液，置室温液化，以离心沉淀法（1350×g，5min），除去精浆，用约 20倍沉淀精子量的 10% 灭活未婚妇女血清生理盐水（UW S-生理盐水）洗涤沉淀精子 2次，然后再用少量 10% UW S-生理盐水加入沉淀精子块上面，轻轻摇散底部的精子沉淀块，置室温 5～ 10min，收集上层浮游的活动精子，用 10% UW S-生理盐水调整精子浓度为 40×106/mL，供实验用。
（3）补体血清：采用市售或自制的豚鼠血清。
【方法】
（1）待检血清用灭活的未婚女性血清或 10% 灭活家兔血清作对倍稀释。按精子不动化试验方法，测定各稀释度的精子运动率（T% ）。
（2）以标准未婚女性血清为对照，测定其精子运动率（C% ）。
（3）根据 C - T×100公式算出各血清稀释度精子制动化率（Y）。
【判断】
以 Y 作纵轴，血清稀释倍数作横轴，绘出 S状弯曲的衰减曲线，这条曲线与 50% 精子运动率直线相交叉点的血清稀释倍数即为 50% 精子制动抗体效价（ST）。也就是该被检血清所含的抗体量。
根据同一个体不同时期的检测结果可以观察其抗体量的动态变化。或者多个样品同一时间检测结果亦可以比较个体间所含抗体量的不同，这对病态和临床治疗效果的判断是一种非常重要的检查手段。定量精子制动化试验的特点是定量准确、重复性好，即使是轻微变化，亦能作出判断。缺点是操作程序繁多，一次不能作多个样品处理，一般需要先作定性测定，对阳性样品再进行定量检查。为了使检测结果无误，每次检测时，最好用标准阳性血清作对照，以便校正样品所得的结果。
（三）微量精子制动试验
当检测的样品不是血清，而是宫颈黏液和子宫、卵管分泌液时，由于样品取材量少，难得，采用微量测定法可以弥补以上的不足。而且所得结果与半定量精子制动试验无异，所以作者的实验室即是测定血清中的抗体，亦采用微量精子制动方法。
【准备】
（1）准备微型反应板一块。
（2）将液状石蜡置 32℃ 预温。
（3）精子悬浮液及补体的制备与半定量精子制动试验相同。
（4）子宫、卵管内分泌液经高速离心，除去有形成分，再进行 56℃ 30min灭活处理。
（5）宫颈黏液提取液的制备：于排卵前，从子宫颈管取透明的宫颈黏液，放入尖底塑料小离心管内，称取黏液重量，按宫颈黏液 1mg加入灭活未婚女性血清 1μL的比例加入血清，充分搅拌后，放置 4℃ 30min，用 9700× g，30min离心分离，吸取上清作为宫颈黏液提取液，把宫颈黏液的可溶性成分估计在内，提取液的浓度作为原血清的 2 倍稀释。再经 56℃30min灭活处理后供实验用。
【方法】
（1）取微型反应板，用预温的液状石蜡充满。
（2）用微量移液器，分别把提取液 10μL，精子悬浮液（40× 106/mL）1μL，补体血清 2μL注入由液状石蜡封面的微型反应板孔内。
（3）对照设两组：① 补体对照：不加补体或以灭活补体血清代替；② 检体对照：用灭活处女血清代替；③ 用振荡法混合后，置 32℃ 孵育 1h、2h、3h；④ 取出后，用倒置显微镜（200× ）计算实验组和对照组的精子运动率（T% ，C% ）。
【判断】
当 C% 与 T% 之比在 50% 以下时，即精子制动值 SIV = C/T≥2时，判为阳性。
（四）精子制动试验应注意的事项
1.血清制备 由于豚鼠血清中，含有对人精子有毒性的物质，因此用作补体的豚鼠血清，应在合并之前逐只检查，仅把无精子制动作用的豚鼠血清合并，用溶血反应测定血清的补体效价（C'H），以无精子制动作用的未婚女性血清，调整补体效价为 200C'H 左右，确保制动反应系统有足够的补体量（10C'H）参与。豚鼠血清以 0.5mL 分装于小试管内，置 - 70℃保存备用。
（1）作补体用的豚鼠血清制备：一次用 10～ 15只豚鼠，分别从心脏采血，低温下分离血清，分别以精子制动试验检测对人精子有无毒性，具体方法如下。
1）试验组：
处女血清 0.25mL
精子悬浮液（40×106/mL） 0.025mL} 32℃/60min精子活动率（T% ）
待检豚鼠血清 0.05mL
2）对照组：
处女血清 0.25mL
精子悬浮液（40×106/mL） 0.025mL } 32℃/60min 精子活动率（C%）
灭活豚鼠血清（或不加豚鼠血清） 0.05mL
两者比较 C/T≥1.2 判为有毒性，<1.2 判为无毒性。
把 1.2以下的豚鼠血清合并后，再测补体效价。
此外有人用 AB 血型的人血清作补体，不过 AB 血型人血清的补体效价比豚鼠血清要低得多，反应系统加入 0.05mL 血清仍不能充分把制动抗体检出，因此一般不采用。
2.精子洗涤 精液采用丈夫或他人的都可以，都能取得相同的结果。但由于不孕妇女血中的精子制动抗体多数是由精浆抗原所产生的抗体，精浆有中和抗体的作用，会影响测定的结果。所以制备精子悬液时，首先要用 10% 家兔灭活血清洗涤精子，尽可能把精浆成分除去，以免降低精子制动抗体的效价。
三、精子细胞毒试验（Ham m etlynck and Rum ke方法）
抗精子抗体与精子结合后，在补体参与下，可导致精子制动和死亡，利用台盼蓝或伊红Y 等染料使死精子染色，间接验证血清或分泌液中是否有制动精子的抗体存在。
（一）台盼蓝染色法
【准备】
（1）待检血清的分离和灭活补体。
（2）AB 血型人血清（补体）制备。
（3）2% 台盼蓝液配制（用蒸馏水）。
（4）台盼蓝-生理盐水溶液配制：取适量生理盐水，加等体积 2% 台盼蓝水溶液，混匀即可。
（5）配制 0.01 mol/L，pH 7.4 PBS 溶液。
【方法】
（1）取正常新鲜精液［精子浓度为（40～ 100）× 106/mL］用 pH 7.4 PBS作 1∶10 稀释，以500r/min 30min离心洗涤一次，弃去上清，沉渣用 PBS调整精子浓度为 100× 106/mL 的精子悬液。
（2）在小试管内加入 1滴待检血清，1滴精子悬液和 2滴补体血清。置 37℃ 孵育，并于30min、60min分别追加 2滴补体血清，直至 90min后加入 1滴台盼蓝生理盐水溶液，继续孵育 60min，取出小试管，以 500 r/min，30min离心，弃去上清，将沉渣涂片，待干燥后镜下观察。以阴性血清作对照组，以同样条件和方法处理。
（3）计数：对照组：记录数至 100个无染色精子（活精子）时所需的总精子数（含 100个无染色精子加一定数量染色的死精子）。实验组：记录对照组相应的总精子数，把其中所含的无染色精子（活精子）数作 X。将 100- X 所得的数目，即为被检血致死的精子数，这个数目称为精子毒性指数（STI）。
【判断】
（1）STI>25时，P≤0.01，判为阳性。
（2）STI在 15～ 20之间，判为可疑。
（3）STI<15时，判为阴性。
本法所得阳性率与精子制动试验的阳性率较为一致。
（二）伊红 Y 染色法
【准备】
（1）用蒸馏水配制 4% 伊红 Y 染液。
（2）配制 0.01mol/L，pH 7.4 PBS溶液。
【方法】
（1）取正常新鲜精液（精子浓度宜大于：60×106/mL），用 pH 7.4 的 PBS洗涤 3次，调整精子浓度为 10×107/mL。
（2）取精子悬液 16μL，移置载玻板的漆孔内，分别设 2个测定和对照孔，另取待检血清20μL，补体血清 4μL 加入测定孔内，对照孔只加待测血清不加补体，充分混匀。
（3）把玻板移入湿盒内，在 37℃ 孵育 30min，每孔加 4% 伊红 Y 4μL，加上盖玻片使其作用 2min，进行镜检。
【判断】
由于活精子不着色，死精子着染为红色，计算 200个精子中，死精子所占的百分数，减去对照组死精子的百分数，即为抗体杀灭精子的百分率。以杀灭精子≥10% 以上者为阳性。
四、免疫组化法检测抗精子抗体
当分布于组织中的物质能作为抗原时，则可在组织片上观察该物质的抗原抗体反应，为此所采用的技术方法统称为免疫组织化学方法。
一般说来，发生在组织或细胞内的抗原抗体反应是不可见的，借助于荧光素、酶等标记抗体与相关的抗原相结合。由于荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定的显色处理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准确地对相应的抗原或抗体进行定位或定性。免疫组化是一种高度敏感和准确的技术，可分为用荧光标记抗体的荧光抗体法和用辣根过氧化物酶等酶类结合在抗体上，用以观察产生酶反应的活性部位的酶抗体法。
（一）间接荧光抗体试验
将已知抗原（精子）与第一抗体（待检血清）结合后，再与经异硫氰酸荧光素（FITC）标记的第二抗体结合后，在荧光显微镜下，可见绿色荧光，从而判断患者血清中是否存在抗精子抗体。
【试剂】
（1）0.01mol/L pH 7.4 磷酸缓冲液（PBS）。
（2）甲醇（分析纯）。
（3）羊抗人 IgG-FITC。
【方法】
（1）取正常男性精液，自然液化。
（2）PBS离心洗涤 3次，去除精浆，调精子浓度为 5×104/mL。
（3）精子悬液涂片，室温自然干燥。
（4）甲醇固定 10min。
（5）滴加待检血清、阳性血清、阴性血清（处女 AB 型血清），37℃ 湿盒30min。
（6）PBS洗 3次，每次浸洗 3min。
（7）滴加羊抗人 IgG-FITC，37℃ 湿盒 30min。
（8）PBS洗 3次后，荧光镜下观察结果。
【结果】
荧光镜下观察，精子头部、中段出现荧光为抗精子抗体阳性。
（二）固相酶染色法（solid-phase enzyme stain assay）
精子抗原与第一抗体（待检血清）反应后，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（Fab）2［HRP-羊抗人 IgG（Fab）2］片段结合，在酶催化底物的作用下，进行显色反应，得到具有一定电子密度的有色产物，从而可间接判断待检血清中是否存在相应的抗体。
【试剂】
（1）0.01mol/L pH 7.4 磷酸缓冲液（PBS）。
（2）HRP-羊抗人 IgG（Fab）2。
（3）底物溶液：3，3'-二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）5mg，先用 0.1mL 二甲亚砜（分析纯）助溶，再加 PBS 5mL，3% H2O20.05mL，临用前配制。
（4）甲醇（分析纯）。
【方法】
（1）取丈夫新鲜精液，液化后离心去上清。
（2）沉淀用 PBS离心洗 3次，最后配成 5×104/mL 精子悬液。
（3）精子悬液涂片，一式两份，室温自然干燥。
（4）甲醇固定 10min。
（5）分别加夫妇血清、已知阳性血清和阴性对照血清（处女 AB 型血清），37℃ 湿盒30min。
（6）PBS洗 3次，晾干。
（7）加 1∶1000稀释的 HRP-羊抗人 IgG（Fab）237℃ 湿盒 30min。
（8）PBS洗 3次。
（9）加底物溶液，37℃ 湿盒反应 15min。
（10）PBS洗 3次，吹干镜检。
【结果判断】
油镜下观察，精子呈棕黄色为阳性，精子不着色或极淡黄色为阴性。
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