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抗精子抗体的检测方法

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核心提示:即使精卵结合后受精成立,由于受精卵仍携带有精子抗原,受抗体的作用,受精卵仍会在发育过程中死去。

  在进行抗精子抗体检测之前,有几个基本概念需要说明。

  (1)由于精子抗原的复杂性决定了相应抗体的多样性,试图用一种检测方法检出全部抗体是不可能的。

  (2)随着生殖生物学和免疫学的进步,新的检测方法不断创立,至目前为止,抗精子抗体检测方法已有 10多种,应根据临床或研究目的、抗原定位以及与不孕、不育的关系等进行选择。

  (3)目前,在众多检测方法中,没有一种是对不孕症完全特异的抗体检测法,因为与精子结合的抗体,不一定都能造成精子生物功能障碍。临床关注的是与不孕症呈因果关系的抗体。对这类抗体的检测,女方主要检查女性血清中与精子膜抗原发生反应的抗体,检测方法多用免疫珠法和 MAR 试验进行筛选,然后用精子制动化试验和体外受精阻断试验作进一步鉴定。男性方面,主要也是检查与精子膜抗原反应的抗体,除进行免疫珠检测、MAR 试验外,可以用凝集试验、制动化试验、受精阻断试验来确定抗体的生物学活动。

  (4)抗精子抗体检测法的分类,当前还没有统一,但分类的原则主要是根据抗体的生物活性;抗体与活精子膜抗原的结合性和与精子及其提取抗原的反应性。有人分为 2 类,亦有人分为 3类。在此,引述 1993年繁田实采用的分类表供参考(表 9-1)。

  表 9-1 抗精子抗体的检测方法

  A.与精子及其提取抗原反应的抗体检测法

  1.致敏血球凝集反应

  2.间接荧光抗体法

  3.放射性核素标记测定法

  4.酶联免疫吸附法

  B.与运动精子膜抗原结合的抗体检测法

  1.检测与抗原结合性的方法

  (1)免疫珠测定法

  (2)混合抗球蛋白反应试验(MAR)

  2.检测抗原结合性及抗体生物活性方法

  (1)精子凝集试验

  (2)精子制动化试验

  (3)受精阻断试验

  注:A 法以固定精子作抗原,适用于间接荧光法和 ELISA 法等。

  B 法以活精子膜糖蛋白作抗原,适用于与膜抗原反应的抗体检查。

  一、精子凝集试验

  精子凝集试验从最初由 Kibrik等(1952年)创立的白明胶内精子凝集试验开始连同其后的发展,一共有 4 种:① 明胶凝集试验(Kibrik,1952);② 试管玻片凝集试验(Franklin,Dukes,1964);③ 毛 细 管 凝 集 试 验(Shulman,Hekman,Pann,1971);④ 浅 盘 凝 集 试 验(Friberg,1974)。

  (一)明胶凝集试验(gelatin agglutination test,GAT)

  【准备】

  (1)配制 Baker液(Bakersolution)

  葡萄糖3.00gNa2HPO4·7H2O0.46g

  NaCl0.20gKH2PO40.01g

  加双蒸水至 100mL。

  (2)用 Baker液配制 10% 白明胶溶液,并置 37℃ 水浴中备用。

  (3)精子悬浮液:取正常新鲜精液(精子密度为 80×106/mL 左右,活动率 >60% ,a、b两级活动精子 >70% ),室温液化,用 Baker液稀释至 40×106/mL,置 37℃ 水浴中保存备用。

  (4)待检血清及对照血清处理,均经 56℃ 水浴加热 30min,以灭活补体。随后用 Baker液,将两种血清均作 1∶4~ 1∶32倍数稀释,存放于 37℃ 水浴中备用。

  【方法】

  (1)取一定量的精子悬浮液,加入等量的 10% 明胶溶液,充分混合后,取 0.3mL 分别加入装有 0.3mL 对倍稀释血清的各支小试管内,并使其充分混合。

  (2)将混合液分别用毛细吸管移置另一小试管(3mm ×30mm)内,37℃ 孵育 2h,移置 4℃放置 5min,待明胶凝固后,观察明胶内精子凝集情况,并判断结果。

  【判断】

  (1)阴性:精子在明胶内均匀分散,若以黑纸作背面对光观察,呈均匀乳白色,不见凝集块。

  (2)阳性:精子成小凝集块,对光观察可见小凝集块有如雪花纷飞状,不难鉴别。

  (3)抗体效价:以阳性反应的最高血清稀释倍数为血清凝集抗体效价。

  (二)试管玻片凝集试验(又称为 F-D 法)

  【准备】

  (1)配制 Baker液(同上)或生理盐水。

  (2)从患者血液中分离血清,经 56℃ 30min灭活补体处理,并以 Baker液或生理盐水把原血清作 1∶5稀释。

  (3)精子悬浮液:取新鲜正常精液(同上)以 Baker液或生理盐水调整精子数为 4 ×106/mL。

  【方法】

  (1)取 0.25mL 处理后待检血清移置一小试管,加入 0.25mL 精子悬浮液。在另一小试管内加0.25mL Baker液或生理盐水,再加入 0.25mL 精子悬浮液作阴性对照。

  (2)在 37℃ 条件下孵育 30min、60min、120min、240min,从小试管内分别取出一滴混合液放在载玻片上,加上盖玻片。

  (3)在高倍镜下(400× ),观察精子凝集情况。

  【判断】

  阴性:未见精子凝集。

  阳性:在 10个高倍视野下,有 5个以上视野出现 2个以上精子凝集者,判为阳性。

  注:1991年张秀成对本法的操作略有变动:① 精子悬液,取新鲜精液后,用 Baker液洗3次,调精子浓度为 5×106/mL 供试验用;② 血清及精子悬液用量均为 0.1mL;③ 37℃ 孵育 1h;④ 有 3条精子以上凝集为阳性。

  (三)毛细管凝集试验(sperm agglutination testin capillary tube)

  【准备】

  (1)配制 Baker液。

  (2)制作精子悬浮液:把新鲜、正常、液化后的精液用 Baker液调整精子浓度为 40 ×106/mL。

  (3)用 Baker液将灭活处理后的待检血清作对倍稀释。

  (4)毛细管内径 1~ 2mm,长度 75~ 100mm,经清洁灭菌处理。

  【方法】

  (1)取一定量精子悬浮液与等量对倍稀释后待检血清混合。

  (2)把混合液灌注入备用的毛细管内,两端用橡皮泥密封,直立于室温(20~ 25℃ )温育1~ 2h后观察结果。

  【判断】

  (1)阴性:毛细管内呈均匀乳浊色。

  (2)阳性:可见毛细管内有小凝集块。

  (3)抗体效价:以阳性终点的血清稀释倍数为凝集效价。

  注:凝集精子,若采用经 Baker液洗净的精子作悬浮液后效价可能提高。

  (四)浅盘凝集试验(tray agglutination test,TAT)

  【准备】

  (1)配制 Baker液。

  (2)用 Baker液配 10% BSA。

  (3)洁净浅盘(或微量反应板)。

  (4)精子悬浮液:将精液分装于 2~ 3支小试管内,其面叠加 10% BSA 0.5mL,放置 37℃1h,收集上层精子,用 Baker液调整精子浓度为 40×106/mL。

  (5)将待检及对照血清作灭活补体处理(56℃ 30min),然后把血清进行 1∶4~ 1∶32对倍稀释。

  【方法】

  (1)浅盘孔上加液状石蜡覆盖,分别以微量加样器把 5μL血清及 1μL精子悬液注入浅盘孔的底部,并用小型振荡器使其充分混合。

  (2)放 37℃ 1h或室温(25℃ )4h温育。

  (3)用倒置显微镜,观察结果。低倍镜(40× ,100× )看凝集总体情况,高倍镜(200× ,400× )观察凝集型。

  【判断】

  (1)阳性:1∶8以上血清稀释度有明显的精子凝集块。

  (2)阴性:精子呈分散自由活动,无凝集块。

  (3)凝集强度:精子全部或≥75% 凝集记" + + + ";

  精子有≥50% 而≤75% 凝集,且有较大的凝集块记" + + ";

  精子有≤50% 凝集,凝集块小而分散记" + "。

  (五)改良浅盘法(改良 TAT 法)

  【准备】

  (1)配制 0.01mol/L pH 7.4磷酸缓冲液(PBS)。

  (2)配制 0.01% 葡萄糖-PBS。

  (3)以 Costar组织培养板(3696)代替浅盘。

  (4)Hamilton微量注射器(50μL)型号 1705。

  (5)待检血清在 37℃ 水浴中融化,并在 56℃ 30min作灭活处理。用 0.01% 葡萄糖-PBS把血清作 1∶16、1∶32、1∶64对倍稀释。

  (6)精子悬液:新鲜液化精液首先通过玻璃棉过滤,以除去碎片和杂质块,并用 0.01%葡萄糖-PBS液调精子浓度为 40×106/mL。

  【方法】

  (1)每份稀释血清取 30μL加入 96孔 Costar组织培养板孔内,外周一行板孔不用,因外周一行板孔蒸发快,每孔再加入 3μL精子悬液。

  (2)把培养板移入 37℃ 湿盒内,孵育 2h。

  (3)用倒置显微镜的低倍镜(40× ,100× )观察凝集程度,以高倍镜(200× ,400× )观察凝集型。

  【判断】

  (1)精子有明显凝集为阳性,精子分散无凝集为阴性。

  (2)凝集精子达≥75% 记" + + + ",凝集精子在≥50% 和≤75% 时记" + + ",凝集精子≤50% 时记" + "。

  (3)血清效价:精子凝集至少在 1∶16 和 1∶32 两个稀释度出现时,才判血清抗体为( + ),若只有一个稀释度出现凝集(如 1∶16),而 1∶32无凝集,则要重试 1∶8、1∶16、1∶32,抗体效价为出现凝集终点的血清稀释度。

  (六)凝集试验的评价

  (1)以上 4种凝集试验基本原理相同,方法不同,各有特点。其中以浅盘凝集试验敏感性最高,样品及精液用量少,既可定性、又可定量,还可以定型,适用于大量样品检查。

  (2)精子凝集素属γ-球蛋白,可被洗净精子或精浆吸收,说明它是抗精子精浆抗体之一,但精子有非特异性自凝现象,类固醇激素引起的β-球蛋白以及样品中的支原体、衣原体、病毒等微生物都可能使精子出现凝集。因此,排除非特异性凝集现象是整个凝集试验的关键:① 每次试验应设立已知阴性和阳性血清作对照,凡对照不能确立,要重复试验。阴性对照成立表明实验结果可靠,阳性对照相符表明试验结果的敏感性和准确性。② 试验用精液需新鲜正常,待检血清不得污染,对照血清要作 100μL 分装置在 70℃ 保存,用时溶解。稀释液要新鲜配制。③ 待检血清开始用 1∶16、1∶32、1∶64三个稀释度筛选,3个稀释度均无凝集者判为阴性,2 个稀释度出现凝集判为阳性,1∶64 有凝集时,血清需往上稀释(1∶64、1∶256、1∶1024、1∶4096)重新测定,直至测出阳性终点为止。

  (3)低效价的凝集素不一定是抗精子抗体,但高效价的精子凝集素肯定是抗精子抗体,而且与不孕症有关,因此临床上把血清效价在 1∶8以上者作为有诊断意义的界限。

  (4)精子凝集类型大致有 4 种,即头对头、尾对尾、中段对中段和混合型等。有人认为头对头一般为 IgM,IgG;尾对尾、中段对中段则为 IgG。不过人们已注意到当抗体效价非常高时,在低稀释度显示的凝集类型与高稀释度的凝集类型不一样,如低度是混合型,而高度是头对头型。因此,通常的凝集活性以少于 30% ~ 50% 精子凝集时的稀释度作为滴度记录。

  二、精子制动化试验(1968年 Isojim a等)

  1968年 Isojima等人建立了依赖补体的精子制动化因子的检测方法,最初建立的是精子制动化半定量测定法,其后发展为定量测定法、微量测定法。1990 年辰已贤一等提出了简化的精子制动化试验。

  (一)半定量精子制动化试验

  【准备】

  (1)精子悬浮液:取正常新鲜精液,置室温液化 20min,加入 3~ 4倍量 10% 灭活兔血清生理盐水,充分混合后以 1000r/min,5min离心,去上清,沉渣以 10% 兔血清生理盐水溶液10mL 造成混悬液,如此洗涤 2次,尽量除去精浆,第 2次洗涤后的精子沉淀,用 10% 兔血清生理盐水溶液调整精子浓度为 40×106/mL,或者就在沉渣上面轻轻加入适量的 10% 兔血清生理盐水,静置室温,让活动精子上游,收集上层精子,调整浓度为 40×106/mL 备用。

  (2)阴性对照血清:取未婚妇女血清,经 56℃ 30min 灭活处理后,预作精子制动化检测,证明无精子制动作用,以 0.5mL 量分装于小试管内,置 - 20℃ 中冻结保存,临用前取出一支溶解备用。

  (3)补体血清:采用市售或自己制备的豚鼠血清。

  【方法】

  (1)A 小试管(试验管):加入灭活待检血清 0.25 mL,精子悬浮液 0.025 mL,补体0.05mL,充分混合后,置 32℃ 孵育 60min。

  (2)B 小试管(对照管):加入对照血清 0.25mL,精子悬浮液 0.025mL,补体 0.05mL,混合后作同上处理。

  (3)C 小管(患者血清对照管):目的是观察患者血清有无使精子出现非特异性制动作用。因此在 C 管中加入患者血清 0.25mL,精子悬浮液 0.025mL,但不加补体,混合后作同上处理。

  (4)精子不动化值计算:孵育之后,分别从 A、B、C 管各取 1滴混悬液放在载玻片上,用显微镜(200~ 400× )观察活动精子数,具体可观察 4个视野,每个视野数 50个精子,总数中求出运动精子的百分率,即精子的运动率(% )。

  【判断】

  A 管的精子运动率为 T% ;B 管的精子运动率为 C% ;精子不动化值(sperm immobiliza-tion value,SIV)为 SIV =B 管 C%/A 管 T%=C/T≥2为阳性。

  C 管只作为试验是否成立的判断,若 C 管出现制动作用,说明检体血清有非特异性制动作用,故试验不成立。

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