精子好动与否 来个测量吧

　　四、显微摄像技术

　　（一）背景

　　20世纪 80年代初，Katz和 Qverstreet首次报道应用显微摄像术（videomicrography）评价人类精子活动力。这种方法依靠手动放映装置分析录像带，从而得出活动精子的百分比和VSL 值。应用此方法，可以同时对精子个体进行形态学评价，并已证明：① 同一精子样品中，与形态正常的精子相比，形态异常的精子更有可能是无活动力或活动力弱的精子；② 与有生育力男子相比，不育男子射出的精液中，形态学正常的精子中出现活动精子的概率相对较低，且游动也更慢。

　　（二）半自动化与自动化方法

　　有关应用电脑辅助的半自动化录像追踪技术分析活动精子的研究已有报道。但半自动化方法，更多的是用于根据手工方法再现的精子轨迹计算精子运动特征。尽管用于评价人类精子形态学的自动化方法已经建立，但尚未能与精子活动力自动化分析系统结合起来以提供"形态-活动力评估"（morphility assessments）。最近，出现了很多对录像信号进行计数图像分析的自动化系统，这些信号是由照相机或摄像机记录下来的。有人曾经预言摄像-电脑系统将常规用于精子活动力评估，现在这一预言确实已成为现实。这些自动化方法基本上使半自动化方法多少有点多余。自然半自动化系统在尚未拥有昂贵的自动分析仪的实验室里仍有其用武之地。

　　（三）技术方面

　　1.电视标准 关于录像的一个混淆因素是全世界有多种不同电视广播和录像标准。这些标准可分为三大组，各组间又有其微小差异。如美国国家电视标准委员会（the NationalTelevision StandardsCommittee，NTSC）系统拥有 525条线路，在 60Hz以 2∶1隔行扫描，图像播出速率为每秒 30个画面。逐行倒相制（phasealternatingline，PAL）和顺序传送色彩与存储制（sequentialcouleuravecmemoire，SECAM）两系统均有 625条线路，50 Hz扫描速度为每秒提供25个画面。

　　尽管 PAL 和 SECAM 在彩色方法或彩色讯号编码上有差别，使其与彩色电视标准不兼容，但当仅用单色图像（以进行计数图像分析）时，则可认为两者基本相同的。目前 NTSC 标准已在加拿大、智利、韩国、中国台湾、美国及其他一些国家和地区中使用。而使用 PAL 标准的国家除中国内地之外尚有阿根廷、澳大利亚、奥地利、比利时、巴西、丹麦、芬兰、德国（前西德地区）、中国香港、冰岛、印度、以色列、朝鲜、卢森堡（德语区）、荷兰、新西兰、挪威、巴基斯坦、新加坡、南非、西班牙、瑞典、土耳其、阿拉伯联合王国、英国、南斯拉夫；使用 SECAM系统的国家则有埃及、法国、德国（前东德地区）、希腊、伊朗、伊拉克、卢森堡（法语区）、波兰和独联体各国。

　　电视标准的差异导致一个显著的后果是各国在应用连续图像分析时，其图像播出速率要么每秒 25个画面，要么每秒 30个画面。虽然这不会使精子运动特征产生很大差别，但这种差别是存在的，特别是在进行 VCL 测定时。

　　2.录像标准 同样存在数种不同的 VCR 标准。索尼公司一直负责 U-M（U-Matic）和 B 系统，但前者基本上限于广播和严格的研究应用，而后者广泛地应用于家庭中。新近又研制了一种超 B 改良系统（superbetavariant）。B 标准 VCR 有三种速度（速度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），几乎所有机器均能以这三种速度播放录像，通常仅专业性机器以 B-Ⅰ速度进行录像，家用机器则常常仅以 B-Ⅱ和B-Ⅲ速度录像。在某些录像机上可应用已问世的新 B-IS。但这类磁带只能在那些对新标准兼容的机器上播放。Video8及其兼容 VHS或 VHS-C 已无多大优越性，因为这些标准基本上限于家用录像机。VHS系统也具有符合 NTSC 标准的多种播放速度：在 PAL 制式国家为标准播放速度和长时播放速度。在 SECAM 国家还有第 3个速度，称之为延伸播放速度或超长播放速度。一种新的高分辨率超-VHS（VHS-S）标准也已经问世，但价格昂贵，所有 VCR 系统都按照其制造国电视标准运行，而且必须与一种适当的摄像机联合使用。应该使用最高速度进行图像分析，从而获得最高质量的图像以进行数码化处理，即用 B-Ⅰ、B-Ⅱ或 SP型 VHS。为了尽量减少反复播放过程中磁带疲劳磨损和过度伸展，应该使用基底最厚的录像带，如 PL-250 或 VHS60min带（在 NTSC 地区是 T-60，在 PAL/SECAM 地区则为 E-60）。

　　3.高速系统 已有两种高频画面系统问世，一是 MHS-200系统（日本东京 NAC 联合公司制造），联合应用高敏感性和高分辨率照相机，其操作图像频率高达每秒 200 次。另一系统为 CTS-200，图像频率亦可高达每秒 200Hz（美国加州 SantaRosa运动分析公司制造）

　　4.校正和样本识别 为了校正和识别样本，需用时 /日显示器和文本显示器。这些仪器能在记录之前把文本和数字特征转换成摄像机的输出讯号。作为研究目的，宜使用 For-A，VTG-33时 /日显示器（日本东京 For-A 公司），而作为常规应用，则更为廉价的松下实业公司的产品能完全满足要求。我们已经应用一种文本显示器（美国加州 Santa Barbara Vistek生产的 VTI-800型），该型号的装置允许使用自由文本，而不仅是提供时间 /日期信息。

　　5.光学显微镜（microscope optics） 为了便于手工轨迹再造，可应用正低（PL）和负高（NH）相差显微镜和 Nomarski光学显微镜。PL 相差光学显微镜最为常用，对于视觉分析已完全足够。但有些学者发现 NH 相差显微镜可提供更好图像以进行图像数码分析，而且应该用来作各种记录以供分析（采用机械视频方法）。Nomarski显微镜可提供一个准三维图像（quasi-three-dimentionalimage），在分析鞭毛运动时特别有用。其缺点是需要用更强的光源和（或）更敏感的录像照相机。

　　当制作录像记录时，如同照片或电影显微摄像那样，建议始终尽可能地使用最低倍的物镜，因为这样可拍出亮度更高、焦距更深的图像。倘若分辨率转换不成问题，通常最好使用较低倍的物镜，并结合直接放大（利用照相机目镜）。虽然这并未去除亮度不足的问题，却能提供一个较大的图像，而又不失焦距的深度。

　　（四）运动特征

　　通过录像记录分析精子活动力和运动特征，从最初的 Katz和 Overstreet"牛眼法（bulls-eye）"开始已经走过了一段很长的路程。对于活动的精子，现可通过画面追踪来重现其在一定时间内的运动。分析手工重建轨迹的方法，与对显微电影摄影图像进行分析的手工或半自动化方法基本相同。计算机化精子活动力分析系统（见第五节）可自动再现精子活动轨迹并可获得其运动特征。

　　曲线轨迹长度可用一个曲线表或地图尺进行手工测量。从轨迹的两端开始，所得的两个值进行平均，曲线表也能用来测量肉眼可见的整个轨迹中线或平均轨迹的长度。直线轨迹长度可用直尺测量轨迹的起点和终点之间的距离计算出来。ALH 的测量既可用平行尺（通常沿着再造轨迹取三点即可），也可通过以下方法获得：即精子头部偏离平均轨迹的顶端一侧连至与该顶点相邻的偏向平均线的距离。这一测定可以在重建轨迹后在每个波上重复进行。然后将测得值平均即获得 ALH 之均值或取其最高测量值作为 ALH 最大值。如果ALH 值是通过测量精子头部侧向运动顶点与平均轨迹之间的距离获得的，那么其平均值或最大值乘以 2就代表整个轨迹的宽度。根据曲线轨迹与单位时间穿过平均轨迹的次数即可计算 BCF。至于平均轨迹则可用多种方法获得包括几何连接法（geometric connection）和五点平均拟合法（5-pointrunning average smoothing）。

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