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查精子抗体选酶联免疫吸附试验

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核心提示:反应板包被抗原:将人精子抗原稀释成 3.5~ 5μg/mL,包被液加到聚氯乙烯微量测定板内,每孔 100μL,置 4℃ 冰箱过夜。

  【原理】

  本法用带正电荷的聚氯乙烯(PVC)微反应板,将精子抗原吸附到聚氯乙烯固相载体表面,其固相抗原可与待测标本中抗精子抗体(As-Ab)结合,并与加入的抗人 IgG 酶结合物起反应,形成抗原抗体酶结合物,最终在酶底物作用下而显

  【试剂】

  (1)包被液:0.01mol/L pH 9.6碳酸钠缓冲液:

  Na2CO3 1.06 g

  NaHCO3 0.84 g}加双蒸水至 1 000mL。

  (2)缓冲液:0.01mol/L pH 7.4 PBS:

  【方法】

  (1)精子抗原制备:筛选收集精液常规检查正常的精液,用生理盐水反复离心洗涤,尽可能除去精浆,经超声波超声粉碎,10~ 15min 高速离心,吸上清,测定上清液蛋白浓度,将蛋白浓度稀释为 3.5~ 5.0μg/mL,为精子抗原溶液。

  (2)反应板包被抗原:将人精子抗原稀释成 3.5~ 5μg/mL,包被液加到聚氯乙烯微量测定板内,每孔 100μL,置 4℃ 冰箱过夜。

  (3)封闭处理:次日早晨,倾去抗原溶液,用洗涤 PBS洗 3次,每次 5min,每次洗涤后都要将板在纸上拍干,再加入 1% 的聚乙烯醇溶液 200μL封闭,置室温 1h后同上法洗涤。

  (4)加待测样品:样品用 PBS稀释 100倍,每孔加入 100μL,同时加 As-Ab血清及正常处女血清作分别阳性和阴性对照,置 37℃ 温育 1h,同上法洗涤。

  (5)加酶结合物:HRP-Protein A 以 1∶640稀释,每孔加入 100μL,置室温 1h,同上洗涤。

  (6)酶反应:加新鲜配制的 OPD 底物溶液,每孔加入 50μL,置室温暗处 10min,再加10% H2SO4终止液每孔 50μL。

  (7)结果判定:用酶标测定仪 490μm测其 OD 值,OD 值≥2.0时为阳性。

(实习编辑:黄秀杰)

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