半透明带精子结合试验操作步骤

　　一、人卵的回收与贮存

　　未成熟的人卵可通过 3种途径获得。第 1种为卵巢切除术后立即将卵巢放入冷的培养液中进行活检，并于 48h内将其切成碎块，然后再将组织进一步粉碎，同时寻找完好的透明带。第 2种为卵巢部分切除术后，卵巢组织的处理也可按照上述方法进行。第 3 种来源即是常常由进行 IVF 的夫妇同意下贡献其多余的未成熟、亦未受精的卵子。将未成熟卵子从IVF 胚胎实验室取出之前置于高浓度盐溶液中。

　　二、卵子的漂洗和切割

　　在制备半透明带过程中，应快速融化并漂洗冷冻（置于 DMSO 中）卵子。从贮存瓶中取出经盐溶液处理的卵子并放入培养液中，稍加漂洗，把切割刀固定于显微操作器上，切割碟置于显微镜载物台上。完好的卵子则浸没于切割碟的培养液中，然后将切割刀定位，使其位于卵子正上方，慢慢下降，从而将卵子切成二等分，去除退变的卵浆后，把两份配对的半透明带放置于同一滴支持液中。

　　三、HZA 操作程序

　　在临床上，精液来源于一位已证明有生育能力的男子（作为对照）以及 1 位或 1 位以上的受检患者。经培养液洗涤后，活动精子于 37℃ 条件下温育 1 h，其间使其进行"上游"（swim-up）。然后首先用培养液稀释上浮精子。将油剂滴入经稀释的部分精子中，并将一份半透明带亦置于其中。即在一滴油剂中加入对照者精子和一份半透明带，在另一滴油剂中则加入受检者精子和另一份配对半透明带。经 4h共培养后，将半透明带取出，并快速用力漂洗，以去除松散附着的精子。然后对于紧密结合于半透明带外表面的精子进行计数（有些精子可结合于半透明带内表面）。根据两份配对半透明带上的精子计数结果来计算患者的HZAI（见上述计算公式）。

　　四、HZA 的质量控制

　　（1）作为一项特定测定，HZA 必须应用配对半透明带。这种方法可提供一种内部质量控制，并得以消除来自两个完好卵子的透明带之间的差异所产生的问题。

　　（2）患者精子对于透明带的结合能力必须跟具有可靠精液质量的正常男子的精子结合能力相比较。

　　（3）在患者与对照者精子滴中活动精子浓度应非常接近，均保持在 5 × 106/mL 左右。计数时宜重复多次，以保证误差不超过 15% 。

　　（4）应定期评估操作人误差。对于从事 HZA 工作的若干操作人员，应比较其对于同一份精液样品的活动精子浓度的计数，尤其是紧密结合于半透明带的精子计数。由于在进行漂洗半透明带及对与其结合的精子计数时，难免存在操作者之间的差异，实验室应尽量减少对 HZA 操作者调换，若要获得准确有效的 HZAI值，应由同一操作者计算结合于配对半透明带上的精子数。

　　（5）对于应用低质量的半透明带或对照精液标本质量低下所进行的 HZA 应及时识别，并对其测定结果不予采用。

　　（6）其培养时间与规定的 4h标准，不应有很大差异，如果其培养时间甚短仅 1～ 2h，则精子与透明带结合率就落在透明带结合动力学曲线的早期阶段，故用于诊断就不可靠。

（实习编辑：黄秀杰）

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